test PCR
Maximilian Reindl ha studiato chimica e biochimica alla LMU di Monaco ed è membro del team editoriale di da dicembre 2020. Si familiarizzerà per voi con argomenti di politica medica, scientifica e sanitaria al fine di renderli comprensibili e comprensibili.
Altri messaggi di Maximilian Reindl Tutti i contenuti di sono controllati da giornalisti medici.I test PCR sono diventati una parte indispensabile della medicina moderna e della diagnostica molecolare. Poiché sono così precisi, sono considerati il "gold standard". Possono essere utilizzati in un'ampia gamma di applicazioni, dal rilevamento di agenti patogeni allo screening per malattie ereditarie, ovvero ovunque sia necessario rilevare in modo affidabile anche le più piccole tracce di materiale ereditario. Scopri qui perché il test PCR è così preciso, dove viene utilizzato e come funziona in dettaglio.
Che cos'è un test PCR?
Un test PCR è un metodo di laboratorio di biologia molecolare e medicina. Il test viene utilizzato per la rilevazione diretta - e la caratterizzazione - del materiale genetico. Il metodo PCR è considerato dagli esperti facile da eseguire, universalmente applicabile e robusto.
In laboratorio, un test PCR si compone di due fasi. In una prima fase, il materiale genetico esistente viene riprodotto con l'ausilio della reazione a catena della polimerasi, o in breve PCR. In questo modo si possono esaminare le più piccole tracce di DNA. Questo è anche il motivo per cui i test PCR sono così sensibili.
In una seconda fase, il materiale genetico viene separato, “ordinato” e quindi caratterizzato secondo le sue proprietà. Quindi viene determinata la struttura fine del DNA.
Ci sono molti usi possibili: i medici usano un test PCR per esaminare, ad esempio, strisci per coronavirus, donazioni di sangue per HIV o screening neonati per possibili malattie ereditarie. Anche le infezioni batteriche - ad esempio con il patogeno della tubercolosi - o le infezioni parassitarie (malaria) possono essere chiarite con la PCR.
Aiutano anche nella medicina legale a condannare i trasgressori in base alla loro impronta genetica o vengono utilizzati come test di paternità.
Tutte queste applicazioni sono riassunte sotto il termine diagnostica molecolare. La PCR trova quindi applicazione pratica nella ricerca, nella diagnostica e nella medicina legale ben oltre la rilevazione del patogeno Sars-CoV-2.
(Corona) PCR test rispetto al test PCR rapido
Di solito, la valutazione di un test PCR avviene in un laboratorio specializzato. Ciò significa che il materiale campione viene inviato ed esaminato lì. Il risultato di solito viene ricevuto pochi giorni dopo.
Diverse startup (GNA Biosolutions, Spindiag) hanno recentemente presentato nuove tipologie di dispositivi mobili di test. Per questo hanno anche ricevuto autorizzazioni speciali dall'Istituto federale per i farmaci e i dispositivi medici (BfArM). Con l'aiuto di questi dispositivi mobili per test PCR, un test PCR sarebbe possibile anche senza un laboratorio specializzato.
Questo approccio ha un grande potenziale, poiché un risultato affidabile del test potrebbe essere disponibile entro poche ore direttamente nel luogo in cui è stato prelevato il campione (centro di test).
La misura in cui tali sistemi di test PCR rapidi prevarranno nella pratica non può ancora essere valutata. Inoltre, non è ancora noto quanto velocemente i centri di prova verranno forniti con questi dispositivi su tutta la linea.
Per il prossimo futuro, pertanto, continueranno ad essere eseguite prove PCR di laboratorio "regolari", che causano un certo ritardo tra il campionamento e il risultato del test.
Quanto è affidabile un test PCR?
La PCR è un metodo di rilevamento collaudato nella diagnostica molecolare e nella medicina. È considerato il cosiddetto gold standard con un tasso di errore molto basso. I test sono particolarmente caratterizzati da una sensibilità e specificità molto elevate.
Per sensibilità si intende l'affidabilità con cui un test trova il materiale genetico da rilevare.
Per specificità si intende la certezza con cui il test determina che il materiale genetico in questione non è presente nel campione.
Quando funzionano i test PCR in caso di infezione da Sars CoV-2?
Di norma, il test PCR rileva un'infezione da corona due o tre giorni prima e fino a 20 giorni dopo l'insorgenza dei sintomi. Anche con le persone infette che rimangono completamente prive di sintomi, il test funziona in una finestra temporale critica in cui possono infettare gli altri.
In singoli casi, la prova è possibile anche 60 giorni dopo la comparsa dei sintomi della malattia.
Il primo giorno dopo un'infezione da corona, anche un test PCR può essere negativo, anche se è presente un'infezione. In tal caso, non c'erano abbastanza virus nella gola al momento dello striscio. Tuttavia, se c'è un ragionevole sospetto di infezione, i medici di solito eseguono un altro test PCR nei giorni successivi.
possibili fonti di errore
Il tasso di errore nel processo di copiatura del DNA è praticamente trascurabile. Sebbene le DNA polimerasi non funzionino mai correttamente, difficilmente svolgono un ruolo nel processo del test PCR.
In pratica, le possibili fonti di errore risiedono nel processo di campionamento: è quindi importante che il personale medico qualificato effettui gli strisci. Campioni di saliva e gargarismi potrebbero ridurre l'accuratezza, poiché qui si verificano effetti di diluizione.
Come funziona un test PCR?
Un test PCR viene effettuato, ad esempio, dal medico di famiglia o in appositi centri di test. In primo luogo, i medici o gli operatori sanitari qualificati prelevano un campione. Di solito, viene prelevato un tampone dalle vie aeree superiori per il test. Questo di solito assume la forma di un tampone boccale o nasale e faringeo.
È anche possibile fare gargarismi con una soluzione di risciacquo. Un campione di sangue è atipico per il rilevamento della corona, ma è diffuso, ad esempio, nello screening neonatale.
Indipendentemente dal tipo di campione prelevato, il materiale genetico si trova sul tampone di cotone, nella soluzione di risciacquo o in una goccia di sangue. Questo materiale campione viene inviato a un laboratorio, dove viene isolato e purificato.
Un test PCR viene quindi suddiviso in due fasi:
- PCR: in questa fase viene moltiplicata la quantità di materiale genetico originale.
- Elettroforesi: nella seconda fase, i segmenti del genoma vengono "ordinati" in base alle dimensioni. In questo modo, il campione può essere caratterizzato - viene determinata la struttura fine del materiale genetico.
Fase 1: PCR - "La reazione a catena della polimerasi"
La "PCR" è la prima di due fasi di lavoro: qui viene moltiplicata la quantità di DNA di partenza esistente. Perché solo quando il materiale genetico è disponibile in quantità sufficiente può essere esaminato. Per lo più si tratta di DNA umano; i test per il coronavirus sono di conseguenza RNA del virus.
L'abbreviazione PCR sta per il termine inglese "Polymerase Chain Reaction".
Cosa è necessario per una PCR?
Il DNA di partenza si trova in un recipiente di reazione con sostanze speciali. Il materiale genetico esistente funge da modello, che viene copiato in presenza di alcuni enzimi (Taq polimerasi) e di alcuni elementi costitutivi del DNA di base.
Il processo di copiatura avviene in più esecuzioni (cicli) ripetitive.
Nello specifico vengono combinate le seguenti sostanze:
- DNA di partenza: materiale campione da replicare.
- Blocchi di base del DNA: sono le basi azotate adenina, timina, citosina e guanina.
- DNA polimerasi: un enzima che collega i singoli elementi costitutivi del DNA per formare un filamento di DNA ben definito. Il filo appena ottenuto è un'immagine speculare (complementare) del materiale di partenza originale.
- Soluzione tampone: La reazione a catena della polimerasi avviene in una soluzione tampone fisiologica. Ciò garantisce condizioni simili a quelle che si trovano nelle cellule umane. Questa soluzione mantiene stabile il pH e contiene anche ioni magnesio. Queste condizioni controllate sono necessarie per garantire la funzionalità della DNA polimerasi.
- Primer: sono costituiti da 16 a 24 coppie di basi e servono come posizione di partenza e segnale di partenza. I primer mostrano alla DNA polimerasi in quale punto (del DNA di partenza) inizia il processo di copiatura.
Come si esegue un test PCR?
Poiché tutte le sostanze necessarie per una PCR sono ora nel recipiente di reazione, può iniziare il processo di copiatura del materiale genetico. Questo viene avviato, controllato e arrestato di nuovo solo dalla temperatura.
Il recipiente di reazione viene quindi riscaldato o raffreddato in modo mirato a diverse temperature. Questo viene fatto con un dispositivo speciale: il cosiddetto termociclatore. La reazione complessiva richiede circa una o due ore.
Le singole fasi di un ciclo PCR sono:
- Denaturazione dei doppi filamenti di DNA: il campione viene riscaldato a circa 90 gradi Celsius. Di conseguenza, il doppio filamento originale del DNA si rompe in due singoli filamenti separati (complementari).
- Applicazione del primer: la temperatura viene abbassata leggermente al di sotto dei 60 gradi Celsius. Di conseguenza, i primer (forward primer, reverse primer) si attaccano a posizioni definite sui corrispondenti singoli filamenti di DNA.
- Estensione: la temperatura viene aumentata leggermente al di sopra dei 70 gradi Celsius. La DNA polimerasi inizia ora il suo lavoro in questa temperatura ottimale. Si attacca alle posizioni dei primer ed estende passo dopo passo il singolo filamento originale di DNA fino a quando non è disponibile una copia esatta (complementare) (sintesi del DNA).
Dopo un ciclo completato, la temperatura viene nuovamente aumentata a circa 90 gradi Celsius - il ciclo ricomincia da capo.
Utilizzando il metodo PCR, le sequenze di DNA possono essere replicate fino a circa tre coppie di kilobasi (kbp). Ciò corrisponde a circa 3.000 elementi costitutivi del DNA di base collegati per formare una "catena". Per fare un confronto: il genoma umano memorizza i progetti e le informazioni per il funzionamento della cellula in circa tre miliardi di paia di basi - il genoma del coronavirus, invece, è costituito da 30.000 paia di basi. Un test PCR può essere utilizzato solo per riprodurre ed esaminare brevi sezioni del DNA totale.
I primer sono fondamentali
La scelta dei primer è fondamentale per il processo di PCR. Nella diagnostica Sars-CoV-2, ad esempio, vengono utilizzati diversi primer (multiplex PCR).
I test Corona PCR cercano tre diversi geni del virus: la specificità complessiva aumenta fino a quasi il 99,99%. Ciò significa che con questo alto tasso di successo, c'è solo un test falso positivo ogni 10.000 esami (se il campione viene prelevato correttamente).
Quanto materiale genetico copiato c'è adesso?
Supponiamo che dopo il primo ciclo ci siano due doppi filamenti identici di DNA.
Dopo ogni ciclo, la quantità di materiale genetico (copiato) raddoppia. Quindi la quantità di DNA cresce esponenzialmente.
In altre parole: dopo il secondo ciclo ci sono quattro doppi fili identici - dopo il terzo ciclo otto doppi fili - dopo il quarto ciclo 16 doppi fili e dopo il quinto ciclo già 32 doppi fili.
I professionisti medici di solito ripetono questo processo da venti a trenta volte.
Metaforicamente parlando, questo significa: anche se all'inizio nel campione è stato trovato solo un singolo doppio filamento di DNA, dopo venti cicli ci saranno già un milione di copie identiche nel recipiente di reazione.
Cosa significa il valore Ct?
Il numero di cicli PCR completati è dato sotto forma del cosiddetto valore Ct. “Ct” deriva dal termine inglese “cycle threshold”. Questo valore Ct consente di formulare dichiarazioni sulla quantità di materiale genetico ricercato.
Con un valore Ct basso di 20, c'è molto materiale genetico di partenza. Tuttavia, se il valore Ct è alto - circa 30 cicli - c'è di conseguenza poco DNA. Il ciclo PCR deve quindi essere eseguito più spesso.
Passaggio 2: elettroforesi "Ordinamento per dimensione"
Infine, se c'è materiale genetico “arricchito” sufficiente, può aver luogo la cosiddetta elettroforesi. Gli scienziati usano una certa proprietà del DNA: la sua carica elettrica.
I singoli elementi costitutivi del DNA sono collegati tra loro tramite uno scheletro di zucchero-fosfato caricato (negativamente). Più lunga è una determinata sequenza di DNA, maggiore è la sua carica elettrica.
Se il materiale genetico viene posto in un supporto specifico (agarosio) e viene applicata una tensione elettrica, i segmenti di DNA iniziano a muoversi a causa della loro carica. Poiché un tratto più lungo di DNA viaggia più velocemente di un frammento più corto, si separano in base alle dimensioni.
In questo modo è possibile esaminare e caratterizzare il materiale genetico. In pratica, un campione sconosciuto con un riferimento noto viene solitamente applicato ad una "linea di partenza" e confrontato tra loro dopo un certo periodo di tempo.
Se la "velocità di migrazione" è la stessa per entrambe le sequenze, ciò significa: Il rilevamento è molto probabilmente positivo: il gene che stai cercando è contenuto nel campione.
Caso speciale del coronavirus: preparazione del campione e RT-PCR
Il rilevamento dei patogeni per il coronavirus è un caso speciale: Sars-CoV-2 è uno dei cosiddetti virus a RNA. Ciò significa che il genoma Sars-CoV-2 è sotto forma di RNA (acido ribonucleico).
L'RNA differisce dal DNA solo in alcuni modi. Tra l'altro, è disponibile come singolo filamento e si basa sullo zucchero ribosio anziché 2 "desossiribosio. La timina nucleobase è stata sostituita anche dall'uracile come quarta base.
Questo RNA virale deve essere "trascritto" nel DNA prima di un normale test PCR. Questo processo è chiamato trascrizione inversa (RT) - da qui il termine RT-PCR. Nel corso di questo processo si ottiene un singolo filamento di cDNA ("DNA complementare"). In una fase successiva, il singolo filamento di cDNA è integrato da un secondo filamento di DNA invertito a specchio.
Alla fine della preparazione del campione, c'è un doppio filamento di DNA che corrisponde al progetto originale dell'RNA del virus: solo questo doppio filamento può ora essere utilizzato come stampo in un test PCR.
Quanto tempo ci vuole per ottenere il risultato?
Dopo aver inviato il campione al laboratorio, di solito riceverai un risultato dopo uno o due giorni lavorativi.Nei centri di prova, che spesso esaminano i campioni in loco, l'operazione può richiedere solo poche ore. Il periodo di tempo dipende in gran parte dal rispettivo centro di prova e dalla sua logistica.
Nonostante i complessi processi di lavoro, i moderni laboratori sono in grado di eseguire test PCR con un'elevata produttività. Dispositivi automatizzati speciali aiutano con l'implementazione.
Il test PCR è ancora considerato un metodo di rilevamento relativamente "lento" ma ancora più affidabile.
Cosa succede se il risultato è positivo?
Se il campione viene prelevato correttamente, un test PCR positivo significa che è molto probabile che la persona testata sia infettata da Sars-CoV-2.
Se è stata confermata l'infezione da coronavirus con l'aiuto di un test PCR, il dipartimento sanitario riceverà un messaggio dal rispettivo laboratorio sul risultato positivo del test. In tal caso, il dipartimento sanitario ordinerà l'isolamento o la quarantena.
Sono automaticamente contagioso se ottengo un test PCR positivo?
La maggior parte delle volte, si. Ma non sempre. Un risultato di un test PCR deve essere sempre interpretato nel contesto. Un test positivo significa principalmente che hai materiale virale in te.
Se hai sofferto di Covid 19 solo di recente (pochi giorni), un test PCR potrebbe essere ancora positivo, anche se sei già di nuovo in buona salute. Questo è un caso speciale e l'aspetto negativo di un test altamente sensibile, poiché può anche rilevare frammenti di un virus che non può riprodursi.
A volte è utile un test anticorpale supplementare
In tali casi, un test anticorpale fornisce la certezza che garantisce la validità del test PCR. È meglio discuterne con il medico. Possono aiutarti a interpretare correttamente il risultato di un test PCR.
Cosa fare se il risultato è negativo
Un risultato negativo del test PCR significa con un'alta probabilità che non hai contratto il Covid-19 quando è stato prelevato il campione e quindi non sei attualmente contagioso. Tuttavia, potresti essere nelle prime fasi dell'infezione.
Di solito, le infezioni da corona possono essere rilevate solo dal secondo o terzo giorno dopo l'infezione. Quindi il risultato non è un biglietto gratuito. Dovresti quindi continuare a osservare le regole di distanza e igiene e continuare a indossare una maschera FFP2 - per te stesso e per la protezione degli altri.
Test PCR nei bambini
Un test PCR pediatrico non è diverso da un test PCR per adulti. Sia il campionamento che l'interpretazione dei risultati si applicano sia ai bambini che agli adulti.
Quali sono i rischi di un test PCR?
Un test PCR non comporta rischi fisici. Solo il prelievo tramite tampone nasofaringeo è percepito come fastidioso o sgradevole da alcune persone.
Quanto costa un test PCR?
Eventuali costi sostenuti per un test PCR saranno coperti se i medici curanti o il dipartimento sanitario approvano tale test. Il rimborso delle spese viene solitamente preso in considerazione se si hanno già sintomi propri o se si è avuto contatti diretti con persone infette.
Anche in caso di test rapido o autotest positivo, hai diritto a un test PCR gratuito.
Nota: se ti sei sottoposto a test a casa e hai ricevuto un risultato positivo, dovresti fissare immediatamente un appuntamento con il tuo medico di famiglia per telefono. Il medico curante discuterà con lei telefonicamente l'ulteriore procedura.
In alternativa, è meglio chiamare il 116 117 per registrarsi per un test PCR. Fino al test di conferma, dovresti idealmente rimanere a casa per proteggere te stesso e gli altri.
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